引言

       全球“染”防控形勢嚴峻，新技術“宏基因組二代測序技術 (mNGS) ”為疑難危重感染提供快速精準診斷依據，指導抗生素的合理應用。以上海華山醫院、北京協和醫院、首都兒科研究所附屬兒童醫院為代表的一線臨床工作者在破解疑難雜癥，成功救助患者的過程中，也收獲了豐碩的科研成果，進一步推進了新技術的推廣普及，更好地助力精準醫療。

       背景介紹

       據WHO對2015年全球死亡原因統計，全球因感染死亡的人數將近1000萬，占全部死亡原因的17%^[1]。各類感染性疾病 (包括法定傳染病) 防控形勢嚴峻，國家公共衛生部門面臨著重大挑戰。

       目前，感染與非感染性疾病的鑒別和感染病因探尋仍是臨床工作者的兩大難題。每年細菌或真菌入血導致的細菌血癥或真菌血癥超過300萬例，死亡率高達20%^[2][3]；每年中樞神經系統感染超過500萬例，不同種類病原感染導致的死亡率從15%-70%不等^[4]。2015年共有約320萬呼吸系統感染死亡案例，其中約有92萬兒童 (<5歲) 死于肺炎，占該年齡段兒童死亡原因的16%^[5]。

       這些感染案例中，超過30%的肺炎^[6]、40-50%的膿毒血癥^[7]以及高達50%-60%的腦炎腦膜炎病因不明^[8]。技術層面的局限是不能鑒明病因的主要因素。目前臨床感染的常規診斷方法血培養方法只能培養細菌/真菌，陽性率僅有8-12%；而病毒PCR檢測靶標有限，且大幅度依賴臨床醫生的經驗，因此臨床亟需新的診斷技術助力診治。

       華大基因研發的基于宏基因組二代測序技術 (mNGS) 的感染病原基因檢測，很大程度解決了臨床感染診治的部分難題。mNGS不依賴培養技術，直接獲取臨床樣本 (血液、腦脊液、肺泡灌洗液等)，應用mNGS和生物信息分析軟件全面鑒定細菌、病毒、真菌、寄生蟲，為疑難危重感染提供快速精準診斷依據，指導抗生素的合理應用。

       僅2017年這一年，華大基因已經用該技術24小時快速鑒定狂犬病毒為臨床提供診斷依據；確證疑難結核性腦膜炎，幫助顱內感染的菲律賓船員安全回家；檢出利什曼原蟲，讓頸部淋巴結腫大、輾轉7家醫院花費30萬的患者查出真實病因…

       為了推進mNGS技術在疑難危重感染方面的應用，華大基因與國內多位頂級臨床專家開展了科研合作項目，近期連續發表了4篇研究論文。

       新思路：動態監測mNGS序列數可評估患者療效？

       mNGS除了快速鑒定病原菌以外，能否多次采集不同治療時間段的樣本測序，根據檢出序列數來評估患者用藥前后是否好轉呢？上海華山醫院感染科張文宏團隊最新發表在《Journal of Infection》的文章報道了最新研究進展^[9]。

       本文報導了mNGS鑒定4例未明病因的疑難發熱患者病因的案例。mNGS分別檢出4位患者感染結核桿菌、新生隱球菌、水痘帶狀皰疹病毒 (VZV)、銅綠假單胞菌。前3例患者隨著針對性治療，腦脊液中的葡萄糖和蛋白水平與mNGS檢出序列數均呈下降趨勢，反映出患者疾病治療效果較好；而第4例銅綠假單胞菌感染患者，腦脊液中的葡萄糖和蛋白水平與mNGS的檢出序列數呈上升趨勢，反映患者疾病出現惡化。

       本文對臨床的疑問給出了明確的回復，即mNGS檢出序列數可以半定量的反映腦脊液中病原體的載量，進一步協助臨床監測疾病進展和治療效果。未來隨著mNGS在臨床病原菌檢測方面的全面應用和成本控制，mNGS可以幫助實現患者疾病進展監測和療效評估。

4例感染患者不同時間段mNGS測序結果

       中國首例：mNGS助力診斷神經性布氏桿菌病 (NB)！

       布氏桿菌病是由布氏桿菌引起的人畜共患的傳染病，每年全世界有超過50萬例的布氏桿菌感染報導。布魯氏菌感染引發的臨床癥狀多樣，且常累及多臟器，中樞神經系統 (CNS) 感染布氏桿菌常被稱為神經型布氏桿菌病 (NB)。常規的培養和血清學檢測法敏感性和特異性都不高，mNGS技術的快速發展促使其成為用于CNS病因診斷的熱點。

       全球目前僅有1例mNGS用于神經性布氏桿菌病 (NB) 的案例報導，北京協和醫院神經科關鴻志團隊則首次在《International Journal of Infectious Diseases》發表了國內mNGS用于臨床中樞神經系統 (CNS) 感染患者布氏桿菌檢出的文章^[10]。研究者采集了2016年6月1日至2017年6月1日臨床懷疑CNS感染患者的腦脊液樣本。mNGS快速檢出4例患者布氏桿菌感染，結合臨床癥狀和RT-PCR結果驗證，患者確診為神經型布氏桿菌病。mNGS檢出序列數從11-104不等，覆蓋度從0.0043%-0.4%不等。4例布氏桿菌感染的確診，展現了mNGS在臨床疑難感染病原檢測應用的突出優勢。

       經驗+新技術：8月齡女童2周不明發熱終于出院！

       兒童CNS的感染是神經內科常見病。腦脊液和血清病原抗體檢測、病原培養和形態學鑒定等常規檢測方法都有一定的局限性，導致部分患兒感染病因不能快速明確，而mNGS技術的優勢則在這一領域凸顯。

       首都兒科研究所附屬兒童醫院張建昭團隊、北京協和醫院關鴻志團隊在《中華兒科雜志》上發表了mNGS在兒童CNS感染方面應用的臨床案例^[11]。

       8月齡女患兒因“發熱12天，間斷抽搐8天，睡眠增多6天”就診，持續間歇性高熱和抽搐。通過mNGS技術檢出單純皰疹病毒1型 (HSV-1) 序列數高達35078條，占比99.66%，覆蓋度為95%，在相對比例和病毒基因組覆蓋度方面都達到了明確診斷HSV-1感染的強度。隨后甘露醇降顱壓后，阿昔洛韋抗病毒及其他對癥治療后患兒痊愈出院。本文表明除不容易發現的病原外，mNGS針對較為常見的皰疹病毒具有明確診斷意義，為臨床不明原因的CNS感染性疾病提供了重要的病原學診斷方法。

患兒腦脊液二代測序結果

       最新評述：腦炎病因診療進展10年回顧

       腦炎病因不明，無法及時精準診治是困擾臨床的難題。過去10年里，新技術的應用和新知識的積累促使腦炎在病因診斷方面取得了極大進展，從而幫助越來越多的腦炎患者獲得精準治療。

       自身免疫系統紊亂和致病微生物如細菌、病毒和微生物等侵襲是導致腦炎發生的兩大主因。自身免疫腦炎和感染性腦炎各有什么特點和研究進展呢？北京協和醫院神經科關鴻志、崔麗英、兒科宋紅梅最新發表在中華兒科雜志的述評則系統性的從自身免疫性腦炎和感染性腦炎兩方面回顧了腦炎診療的進展^[12]。

       在感染性腦炎方面，嗜神經性病毒是感染性腦炎的主要病因，常規需要依靠血清學和PCR確診，而mNGS的臨床應用將感染性腦炎的診斷帶入”測序“時代。mNGS除鑒定常規CNS感染病原菌外，也可用于發現未知的新型病原體，通過與臨床、微生物學家、生物信息分析等多學科專家的共同合作，mNGS將會有效促進我國腦炎的診療水平。

       結語  

       mNGS技術正在處于臨床應用的發展階段，也面臨著諸多挑戰，如標本采集規范的建立，生物信息分析流程標準化設置，檢測報告的專業性解讀等。但所謂創新技術，就是在過去異想天開，在今天勉為其難，在未來習以為常。相信隨著mNGS技術在臨床的普及應用，會進一步助力精準醫學，救助更多患者！

       參考文獻：

       [1] WHO. Global Health Estimates (GHE), 2016. [Accessed 25 Sep 2017.] Available from URL: http://www.who.int/healthinfo/global_burden_disease/en/

       [2] Reinhart, K., Daniels, R., et al. (2017). Recognizing sepsis as a global health priority—A WHO resolution. New England Journal of Medicine, 377(5), 414-417.

       [3] Fleischmann, C., Scherag, A., et al. (2016). Assessment of global incidence and mortality of hospital-treated sepsis. Current estimates and limitations. American journal of respiratory and critical care medicine, 193(3), 259-272.

       [4] John, C. C., Carabin, H., et al. (2015). Global research priorities for infections that affect the nervous system. Nature, 527(7578), S178-S186.

       [5] WHO. Pneumonia, 2016. [Accessed 7 Feb 2017.] Available from URL:http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs331/en/

       [6] Dahyot, S., Lemee, L., & Pestel-Caron, M. (2017). Description and role of bacteriological techniques in the management of lung infections. Revue des maladies respiratoires.

       [7] Gavrilov, S. N., Skachkova, T. S., et al. (2016). Contemporary molecular-genetic methods used for etiologic diagnostics of sepsis. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii, i immunobiologii, (2), 91-99.

       [8] Glaser, C. A., Honarmand, S., et al. (2006). Beyond viruses: clinical profiles and etiologies associated with encephalitis. Clinical Infectious Diseases, 43(12), 1565-1577.

       [9] Ai, J. W., Zhang, H. C., Cui, P., Xu, B., Gao, Y., Cheng, Q., ... & Zhang, W. H. (2017). Dynamic and direct pathogen loads surveillance to reflect disease progression and therapeutic efficacy in central nervous system infection using a novel semi-quantitive sequencing platform. Journal of Infection.

       [10] Fan Siyuan, Ren Haitao, Wei Yanping, Mao Chenhui,Ma Zhenzi, Zhang Lu, Wang Li, Ge Ying, Li Taisheng, Cui Liying, Wu Honglong, Guan Hongzhi. Next-generation sequencing of the cerebrospinal fluidin the diagnosis of neurobrucellosis. International Journal of Infectious Diseases

       https://doi.org/10.1016/j.ijid.2017.11.028

       [11] 張建昭, 陳倩, 鄭萍, 等.  二代測序診斷幼兒單純皰疹病毒1型腦炎一例 [J]. 中華兒科雜志,2017,55( 11 ): 862-863. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0578-1310.2017.11.015

       [12] 關鴻志, 宋紅梅, 崔麗英. 開啟腦炎診療的精準醫學之門 [J]. 中華兒科雜志,2017,55( 11 ): 801-804. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0578-1310.2017.11.001